Este museu foi constituído por iniciativa do Governo da 1ª República, que o criou em 1915.
As coleções, património do Estado, foram sendo reunidas no Palácio Amaral e, de forma definitiva, no expropriado Paço Metropolitano, edifício de aspeto austero, da época filipina (1590-1620).

Segundo uma distribuição científico-museológica as peças distribuem-se pelas seguintes classificações: Arqueologia Pré e Proto Histórica, Arquitetura, Escultura, Epigrafia e Heráldica, Ourivesaria, Pintura e Artes Decorativas.

No claustro encontram-se peças de arqueologia romana e medieval: estatuária romana - esculturas de Ceres (?), séc. d. C. e uma série de aras votivas; o fragmento de uma Ménade romana, baixo-relevo em mármore proveniente de Beja; busto feminino greco-romano, da época antoniana, proveniente das ruínas da antiga Balsa; túmulos de bacantes, de secção cupiforme; um Putto funerário, em mármore, deitado sobre uma pele de leão, achado nas escavações dos Lóios, em 1964; cipos e restos dum friso de templo, possivelmente do séc. III d. C., decorado por bucrâneos e páteras de granito.

Entre a tumulária medieval portuguesa, em calcário, de oficinas eborenses dos séculos XIII-XIV destacam-se os arcosólios em estilo Renascença atribuídos a Chanterenne. A sala primitiva, com arcada geminada, conserva as jacentes dos bispos D. Durando, D. Soeiro e D. Fernando (séc. XIII), provenientes da antiga ábside da catedral, assim como o sarcófago do meirinho-mor de D. Afonso IV, Fernão Gonçalves Cogominho (séc. XIV). A arca tumulária do célebre combatente do Salado apresenta brasões familiares, está decorada pelo Apostolado, com figuras em nichos góticos e decoração trilobada.

Possui, igualmente, um bom núcleo de imaginária e de heráldica: a Santíssima Trindade, em pedra de Ançã, a Virgem, de uma Anunciação, o Salvador, a edícula tumular, esculturada, de Rui Pires Alfageme, os escudos da Casa Real, de Fernão de Colos, o Calvário, da Sé e as pedras de armas da cidade, da casa-de-ver-o-peso e dos demolidos Paços do Concelho.

A sala seguinte apresenta exemplares de arqueologia manuelino-mudéjar: as janelas maineladas da Câmara (1515) e do Quarto da Rainha, do Palácio Real, colunas e capitéis da mesma sede municipal, edificada pelos mestres João Álvares e Duarte de Medina na Praça do Giraldo e arrasada em 1899.

A antiga sala da Relação Eclesiástica, dedicada ao período da Renascença, mostra belas obras de arquitetura francesa e peninsular; túmulos de D. Álvaro da Costa, camaroeiro-mor de D. Manuel, de D. Duarte da Costa, vice-rei do Brasil, e o cenotáfio do bispo D. Afonso de Portugal, dum classicismo muito puro e original, além de duas elegantes pilastras cronografadas de 1533, em mármore, decoradas por medalhões de representação humana e temas mitológicos, conjunto de peças atribuídas ao escultor francês Chanterenne. Outros túmulos quinhentistas, dos Condes de Vimioso, D. Brites de Portugal e de Rui da Grã, chanceler-mor do reino e interessante coletânea de pedras de armas da nobreza alentejana, dignificam a sala que, no último tramo, aberto por curioso portal mudéjar, de arco polilobado, conserva um precioso retábulo, de reduzidas dimensões, da Anunciação da Virgem, majólica italiana de Pizano (cerca de 1520).

No andar nobre encontram-se expostas as secções de Artes Decorativas, incluindo mobiliário português e Pintura, sobretudo flamenga, que constitui o fundo especial do Museu. O vestíbulo, revestido por um silhar de azulejos armorejados, está composto pelas seis tábuas da Paixão, conjunto do ciclo híbrido hispano-flamengo de cerca de 1525, que inicialmente armado na capela do Esporão, da Sé, tinha sido agrupado, como predela, após 1620, ao retábulo do altar-mor.

O salão seguinte, antigo do Dossel e Oratório, apresenta um núcleo notável de mestres anónimos neerlandeses, o políptico da Vida da Virgem, encomendado pelo bispo D. Afonso de Portugal (1485-1522) e constituído por 13 painéis de grandes dimensões que formou, até 1717, o retábulo da primitiva ábside gótica da catedral. Obra de mérito superior foi atribuída a oficinas de Bruges (cerca de 1500), verificando-se terem influências de Gerard David, Hugo van der Goes e Roger van der Weyden. Opiniões mais recentes, de especialistas nacionais e estrangeiros, admitem ter sido efetuado em Évora por pintores arcaizantes flamengos no início do reinado de D. Manuel.

A sala que se segue é dedicada à pintura portuguesa do séc. XVI, encontrando-se tábuas do Presépio, de Frei Carlos, O profeta Daniel libertando a Casta Suzana, de Francisco Henriques, o tríptico do Calvário, atribuído a Gregório Lopes, proveniente da Mitra, a Visitação de Santa Isabel, do ciclo de Garcia Fernandes, pertencente à Casa Pia, Dois Santos Bispos, do mestre do Sardoal e outras pinturas de menor interesse documental, além do famoso esmalte do Calvário, tríptico limosino da escola dos Penicaud (cerca de 1520).

A sala do topo encontra-se decorada com bons móveis nacionais e ingleses, quadros de figuras reais e um belo tapete de Arraiolos, de dimensões invulgares, do período de D. Maria I. A sala de pintura estrangeira seiscentista tem boas peças portuguesas de mobiliário e de cerâmica de inspiração oriental, o retrato de Personagem Desconhecida, de A. de Vris (1631), Patinagem no gelo, de Avercamp, todos da Escola Holandesa, e uma Alegoria, atribuída a Theniers.

As últimas salas são dedicadas à arte nacional: retratos seiscentistas da Rainha D. Luisa de Gusmão e seus filhos D. Afonso VI, D. Catarina de Bragança, ou de figuras contemporâneas; Vice-Rainha Duquesa de Mântua, D. Francisca de Brito, fundadora do Colégio da Madre de Deus, e dois cavaleiros da Ordem de Malta e de Avis. São, igualmente, bastante interessantes a série de miniaturas de óleo sobre cobre, nacionais e estrangeiras, dos séculos XVII e XVIII, nos quais se identificam os presumíveis retratos da pintora Josefa de Óbidos, da rainha D. Luísa de Gusmão e do príncipe herdeiro D. Teodósio, além da coleção de desenhos originais de Vieira Lusitano, executados na sua aprendizagem escolar romana, que foi reunida por D. Fr. Manuel do Cenáculo. As mais recentes secções de Arqueologia e Ourivesaria encontram-se expostas, respetivamente, na primitiva cave do edifício e na remodelada ala Sul do andar nobre. A primeira é constituída pelos fundos antigos da Biblioteca Pública, na sua maior parte reunidos por A. Filipe Simões, Gabriel Pereira e A. Francisco Barata, tendo sido bastante aumentada pelos espólios recentes do Castelo de Geraldo e da Anta do Zambugeiro, segundo critério científico de Afonso do Paço, Henrique Leonor Pina e A. Farinha dos Santos.

O segundo núcleo foi estudado pelo crítico da especialidade Dr. António A. Gonçalves e inclui as peças fundamentais do paço e de extintas igrejas monásticas da cidade, destacando-se: a Custódia, em prata dourada, de estilo Renascença, de Santa Catarina de Sena; as alfaias das ermidas de S. Brás, góticas e barrocas, as de Nossa Senhora da Ajuda e de Nossa Senhora dos Reis, segundo depósito da Câmara Municipal; as lanternas processionais da paróquia de S. Mamede, esculpidas em oficina eborense do mestre Pedro Ferreira (1748); o tinteiro, em prata branca, da Mitra, com marcas lisbonenses de 1690 e as armas gravadas, do arcebispo D. Fr. Luís da Silva, e os restos da baixela de D. Fr. J. Xavier Botelho de Lima (1784-1800).

Igualmente de interesse artístico e romântico é a Galeria de estatuária contemporânea, em fino mármore branco alentejano, proveniente da coleção Barahona e por este cidadão benemérito doada ao Museu da Biblioteca Pública, em 1908. Do núcleo fazem parte, além dos bustos do arcebispo D. Fr. Manuel do Cenáculo, Eça de Queiroz, Oliveira Martins e António Cândido, as significativas obras de Simões de Almeida: Alegria, Tristeza e Puberdade, esta premiada no Salon de Paris, em 1889; Trovador, de Bernardim Ribeiro, e Mocidade, esculpidas por Alberto Nunes em 1888 e 1898, respetivamente; Rapariga da fonte, de Costa Mota (1901); Garoto do Peão, de Aristides Fontana, e Bulha, de Teixeira Lopes (1910).