A 24 de Maio de 1930, e através do Decreto-Lei 18 324, foi instituída na Catedral de Évora, a cargo do Cabido da Sé, o "Tesouro de Arte Sacra", provisoriamente instalado na Sala do Capítulo, graças aos esforços do arcebispo D. Manuel Mendes da Conceição Santos e do Prof. Dr. Gustavo Cordeiro Ramos, na altura ministro da Instrução. Estabeleceu-se, então, que do referido Tesouro fariam parte os objectos artísticos que se encontravam em poder ou sob a guarda do Cabido, além de todos os objectos de valor que fossem entregues ou confiados por particulares.

Devido às reduzidas dimensões da Sala do Capítulo, só puderam aí ser expostos os objectos mais valiosos de ourivesaria, a "Virgem do Paraíso" (tríptico do séc. XIV, único na Península) e duas grandes jarras de porcelana chinesa do séc. XVI, da família Ming. Assim, não ficava exposto ao público o conjunto de escultura, pintura, restante ourivesaria, paramentaria e mobiliário da Catedral.

Por altura da celebração do I Centenário do Liceu de Évora, em Outubro de 1941, entre as diversas salas de exposições encontrava-se a de Arte Sacra, na qual figuravam vários objectos menos conhecidos da Sé, o que fascinou os visitantes. Sugeriu-se, então, ampliar as instalações do Museu de Arte Sacra da Catedral, escolhendo-se as salas que iam da torre Norte pela sobrenave esquerda até à sala gótica por cima da Sacristia.

A pedido do Cabido e com a aprovação de D. Manuel Mendes da Conceição Santos e dos arcebispos seus sucessores na Mitra eborense, a Direcção dos Monumentos Nacionais efectuou as obras necessárias à instalação do novo museu. No entanto, as obras prolongaram-se por um quarto de século, devido aos parcos apoios governamentais, sendo sómente concluídas no início da década de 70.

Graças a generosos subsídios da Fundação Calouste Gulbenkian e da Junta Distrital de Évora conseguiu-se obter todo o equipamento de apoio necessário, encontrando-se prontas as novas instalações do Museu para serem inauguradas em 1976, ano da comemoração do I Centenário do Nascimento de D. Manuel Mendes da Conceição Santos. Mas, a Interpol descobriu a preparação da primeira tentativa de assalto de nível internacional a este Museu e comunicou-o à Polícia Judiciária, suspendendo-se a inauguração das novas instalações até ser colocado um sistema de alarme.

Entretanto, o Museu da Sala Capitular manteve-se em funcionamento, com as necessárias precauções relativamente às peças mais preciosas.

Em finais de Agosto de 1980, deu-se a segunda tentativa frustada de assalto e a 14 de Setembro desse ano os assaltantes conseguiram entrar na Sé e no Museu, embora não tenham levado nada, pois não encontraram o precioso Relicário do Santo Lenho. Este encontrava-se, juntamente com outras peças valiosas, escondido na Sé. A conselho da Direcção Geral do Património e da Polícia de Segurança Pública, as visitas ao Museu foram canceladas, sendo as principais peças guardadas no cofre forte do Banco de Portugal, até ser instalado o sistema de alarme nas novas instalações do Museu. Estas foram, finalmente, inauguradas, com um sofisticado sistema de alarme, a 22 de Maio de 1983, durante as comemorações do VII Centenário da Fundação da Catedral pelo Bispo D. Durando Pais, com a presença das Autoridades Civis e Militares, do Arcebispo D. Maurílio Quintal de Gouveia, Cabido e muitas personalidades de relevo. Por essa ocasião, foi bastante elogiada a grande quantidade e a riqueza dos objectos expostos, assim como o bom gosto do padre João António de Deus, organizador do Museu.

Instalado em três salas da ala Norte, correspondente à torre românica, galerias altas da nave do Evangelho e à "Casa do Tesouro", a sua orientação definiu, em linhas gerais, as espécies expostas ao público, pelas secções mais representativas: Escultura, Pintura, Paramentaria, Mobiliário e Ourivesaria. A visita inicia-se na secção de Escultura, instalada na primeira sala, logo à entrada, pequena e com janelas góticas inseridas em arcos românicos, salientando-se as imagens de Nossa Senhora do Paraíso, um notável tríptico gótico da Escola de Paris (séc. XIV), e quatro estátuas de pedra e terracota, representando as "Santas Mães" (proveniente de S. Tiago), "Santa Trindade", "Santo André" e "S. Sebastião" (de Vila Viçosa). A segunda sala (principal), mais ampla e iluminada por frestas romano-góticas, apresenta um valioso núcleo de espécies artísticas: pintura do séc. XVI, escultura dos séculos XVII e XVIII, paramentaria, ourivesaria e mobiliário. Na pinacoteca destacam-se os valiosos retábulos de S. Francisco e Santo António, da Escola de Nuno Gonçalves; a série da "Exaltação da Santa Cruz", atribuída a Cristóvão de Figueiredo e Garcia Fernandes, e os do ciclo maneirista de Francisco de Campos. Das peças argênteas salientam-se as alfaias dos séculos XVI ao XVIII, com as imagens de Nossa Senhora do Rosário e Nossa Senhora dos Prazeres (de Santo Antão), e uma grande quantidade de paramentos bordados, italianos, espanhóis e portugueses, além dos ternos de D. Teotónio de Bragança, da Inquisição e do arcebispo de Tessalónica, confessor de D. Maria I.
A terceira e última, bela sala gótica (séc. XIV), sobre a sacristia, é particularmente dedicada à ourivesaria mais preciosa e à tapeçaria mais antiga. Apresenta o mais nobre conjunto de ourivesaria do Alentejo, valorizado pelo Dossel Persa da Ordem de Avis e além de peças de prata da contrastaria de Évora, podem ainda admirar-se: a Cruz-relicário do Santo Lenho, revestida por 1426 pedras preciosas, a qual figurou na Batalha do Salado, em 1340; a Custódia-Calix, em gótico-plateresco, do cardeal D. Afonso; o Báculo do cardeal-rei D. Henrique; Cálices de ouro esmaltado, com miniaturas dos Evangelistas e da Paixão de Cristo (1587), italianos, barrocos, e o armoreado de D. Diogo de Sousa (1672); Cruz, de altar, renascença (1540); a Custódia do Corpo de Deus, oferecida pelo arcebispo Fr. Luís da Silva (1695); assim como alguns relicários, incluindo o de S. Manços, oferecido ao Cabido pelo rei Filipe II de Espanha, em 1596.

Este museu tem recebido diversos visitantes ilustres, entre os quais a Rainha Isabel de Inglaterra e o Príncipe de Edimburgo, acompanhados nessa visita pelo Presidente da República, general Ramalho Eanes e por sua esposa, D. Manuela Eanes.

Entre 1980 e 1992 visitaram a Sé e o Museu os Presidentes da Finlândia, Itália e França, assim como o Presidente da República Mário Soares.